你真的了解人臍靜脈細(xì)胞HUVEC實驗步驟嗎？

　　人臍靜脈細(xì)胞HUVEC是一種來源于臍帶組織的干細(xì)胞。它是臍靜脈的重要細(xì)胞之一，在理論上可以無限期地通過。因此，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）經(jīng)常用于血管內(nèi)皮細(xì)胞實驗，而不是靜脈內(nèi)皮細(xì)胞或動脈內(nèi)皮細(xì)胞。臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞易于獲得且來源充足，因此，臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞經(jīng)常用于血管內(nèi)皮研究。那么，您真的了解它的培養(yǎng)實驗步驟嗎？
 

　　1、將15-20cm長的新生兒臍帶儲存在無菌PBS溶液中。（注意：應(yīng)在4℃下保存24小時，在室溫下保存不超過6小時，否則將被丟棄。）

　　2、將鈍針插入臍靜脈管，并用無菌PBS溶液沖洗3-5次，直到將臟血洗凈為止。

　　3、用手術(shù)鉗夾住臍帶下端，添加15ml膠原酶（1mg/ml）在室溫下消化15-20分鐘，并不時搖動臍帶。

　　4、消化后，松開下部的手術(shù)鉗，將消化液倒入50ml無菌離心管中，并用無菌PBS溶液沖洗臍帶2-3次。

　　5、離心收集的液體（2000rpm）3分鐘。

　　6、除去上清液，加入10mlM199培養(yǎng)基（添加10u/mlbFGF），用肘部吹動細(xì)胞，將所有液體轉(zhuǎn)移到裝有明膠的培養(yǎng)瓶中，并在37℃下培養(yǎng)。（注：在每個培養(yǎng)瓶中加入3-4ml無菌1％明膠溶液，充分搖動以使明膠溶液*覆蓋瓶底，并在37℃下孵育至少2小時。使用前將明膠溶液倒入。明膠涂層有助于細(xì)胞粘附。）

　　7、將人臍靜脈細(xì)胞HUVEC培養(yǎng)24小時后，倒出培養(yǎng)基并用無菌PBS溶液洗滌2-3次。洗去紅細(xì)胞和死細(xì)胞，并加入10ml新鮮的M199培養(yǎng)基。

　　8、應(yīng)每2天更換一次介質(zhì)（每次應(yīng)更換2/3的介質(zhì)）。

　　9、培養(yǎng)5-7天后，細(xì)胞可以生長到80-90％的單層，然后可以傳代。

　　10、倒出培養(yǎng)基，用無菌PBS溶液洗滌2-3次，添加2-3ml消化液（0.25％胰蛋白酶+0.1％EDTA）消化細(xì)胞。在顯微鏡下觀察。一旦細(xì)胞變圓，添加2-3次含血清的DMEM培養(yǎng)基以終止反應(yīng)。

　　11、用彎頭吹干細(xì)胞，然后將消化的細(xì)胞以2000rpm的速度轉(zhuǎn)移到50ml無菌離心管中3分鐘。

　　12、倒出上清液，加入10ml新鮮培養(yǎng)基。通常，可以在一瓶中傳代3-4瓶細(xì)胞，然后據(jù)此傳代培養(yǎng)。

　　13、人臍靜脈細(xì)胞HUVEC通常傳代2-3代（約20天）用于各種實驗。